植物組培中常用基本培養(yǎng)方法

　　人們利用植物 組織培養(yǎng)技術快速獲取優(yōu)良植物株系、培育作物新品種等方面，那么如何利用植物組織培養(yǎng)技術再生植株呢?如何鑒定與避免與植物組織培養(yǎng)苗的污染，在此，小編總結了有關植物組織培養(yǎng)技術的七大方面，帶你領略植物組織培養(yǎng)技術的方方面面。

　　第一部分 植物組織培養(yǎng)的概念

　　(廣義)又叫離體培養(yǎng)，指從植物體分離出符合需要的組織.器官或細胞，原生質體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產具有經濟價值的其他產品的技術。

　　(狹義)組培指用植物各部分組織，如形成層.薄壁組織.葉肉組織.胚乳等進行培養(yǎng)獲得再生植株，也指在培養(yǎng)過程中從各器官上產生愈傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織再經過再分化形成再生植物。

　　植物組織培養(yǎng)基礎理論

　　1、植物細胞全能性

　　植物細胞全能性(totipotency)是組織培養(yǎng)的理論基礎。一個生活的植物細胞，只要有完整的膜系統(tǒng)和細胞核 ，它就會有一整套發(fā)育成一個完整植株的遺傳基礎，在一個適當的條件下可以通過分裂、分化再生成一個完整植株，這就是所謂的細胞全能性。但是在自然狀態(tài)下，由于細胞在植物體內所處位置及生理條件的不同，它的分化受到各方面的調控，致使其所具有的遺傳信息不能全部表達出來，所以只能形成某種特化細胞，構成植物體的一種組織或一個器官的一部分。由此可以說明條件是十分重要的，或者說是關鍵的，只要條件合適，細胞潛在的遺傳能力就會表現出來。植物組織和細胞培養(yǎng)技術就是以細胞全能性作為理論依據，用人為的方法創(chuàng)造出一個適合于生長的理想條件，使細胞的全能性得以發(fā)揮。

　　從理論上講，只要是一個生活的細胞，都有再生出一個完整植株的潛力，但實際情況并非如此簡單。就目前所知，細胞的再生潛力與其分化程度呈負相關，就是說細胞分化程度越高其再生能力越低，但也有人認為細胞的再生能力與其分化程度無關，只是人們現在還沒能完全掌握細胞分化的機制。雖然還沒有完全從理論上揭示其原因，但事實是越老的細胞，其基因的表達就越受到嚴格的制約，或者說喪失功能或不表現功能的基因越多，所以應盡量選取幼嫩的植物組織作為培養(yǎng)的實驗材料。同時，還應該考慮到，一定的基因型或外植體的再生能力并不是一成不變的，在不同培養(yǎng)條件下，同一基因型或外植體的表現不同，高度分化的細胞或組織只要條件合適，也有產生再生植株的可能，這種可能性能否變成現實，還有待于人們繼續(xù)努力。

　　2、細胞分化、脫分化與再分化

　　(Cell differentiation,didifferentiation and ridifferentiation)

　　一粒成熟的種子含有一個小小的胚，也可以叫做胚胎。構成胚胎的所有細胞幾乎都保持著未分化的狀態(tài)和旺盛的細胞分裂能力，其細胞質濃稠，細胞核較大，細胞與細胞之間沒有很大差異，這些細胞都可以叫做胚性細胞，或叫分生性細胞或未分化細胞。在適宜的條件下，隨著種子的萌發(fā)，構成胚胎的所有細胞即開始分裂活動，增加細胞數目。隨著時間的進行細胞的命運發(fā)生不同變化，形態(tài)和功能也發(fā)生變化，有的形成了葉子的細胞，有的形成了根的細胞，有的形成莖的細胞，有的仍保持分裂能力，有的則逐漸失去分裂能力，細胞的這種在形態(tài)結構和功能上發(fā)生永久性(不可逆轉性)適度變化的過程叫做分化。分化主要是由細胞內的基因決定的，也就是說分化是基因在時間和空間兩個方面差次表達的結果。分化的結果導致細胞分裂能力的喪失，伴隨的是細胞的分化、成熟與組織的形成，是植物根、莖、葉、花、果實和種子的形成，是一個成熟植物體的出現。在正常的自然狀態(tài)下，這些已經分化的細胞不會再恢復分裂能力重新開始細胞分裂，直到植物體死亡為止。

　　當把一個已經失去了分裂能力，處于分化成熟和分裂靜止狀態(tài)的細胞置于特定的增殖培養(yǎng)基上時，它首先發(fā)生的變化是回復到分生性狀態(tài)，這一狀態(tài)包括由溶酶體的活動而將失去功能的細胞質組分降解，并產生新的細胞質組分(即細胞器的破壞與重建)，同時細胞內酶的種類與活性發(fā)生改變，蛋白質合成和細胞代謝過程也發(fā)生改變，最后引起基因表達的改變，細胞的性質和狀態(tài)發(fā)生了扭轉，可以說是返老還童。由失去分裂能力的細胞回復到分生性狀態(tài)并進行分裂，形成無分化的細胞團即愈傷組織的現象(或者說是過程)稱為“脫分化”(dedifferentiation)。經過脫分化的細胞如果條件合適，就可以長久保持旺盛的分裂狀態(tài)而不發(fā)生分化。由無分化的愈傷組織的細胞再轉變成為具有一定結構，執(zhí)行一定生理功能的細胞團和組織，構成一個完整的植物體或植物器官的現象(或過程)，叫做“再分化”(redifferentiation)。一個已分化細胞要表達出其全能性，就要經過脫分化和再分化的過程，這就是植物組織和細胞培養(yǎng)所要達到的目的。設計培養(yǎng)基和創(chuàng)造合適培養(yǎng)條件的主要原則就是如何促使植物組織和細胞完成脫分化和再分化，培養(yǎng)的主要工作就是設計和篩選培養(yǎng)基，探討和建立合適的培養(yǎng)條件。

　　植物激素在調節(jié)細胞脫分化和再分化中起到主要作用。植物對激素的反應十分敏感，培養(yǎng)基中生長素類和細胞分裂素類的種類、相對比例和絕對量都能直接影響到細胞脫分化和再分化的過程，組培中常常是通過調節(jié)激素的種類、濃度和相對比例來達到調節(jié)脫分化和再分化的目的。

　　3、器官發(fā)生和胚狀體發(fā)生(organogenesis and embryogensis)

　　培養(yǎng)的植物組織與細胞再經過脫分化和再分化再生出新的植物體過程中，特別是再分化時，可經過兩條途徑，一是由愈傷組織的部分細胞先分化產生芽(或根)，再在另一種培養(yǎng)基上產生根(或芽)，形成一個完整的植株，因為芽和根都是植物體的器官，所以這一過程叫器官發(fā)生途徑。另一個是在愈傷組織中產生出一些與種子中的胚相似的結構，即同時形成一個有苗端和根端的兩極性結構，然后再在另一種培養(yǎng)基上同時發(fā)展成帶根苗，由于這一過程與種子中胚的形成和種子萌發(fā)時形成幼苗的過程相似，所以叫做胚狀體發(fā)生或無性胚胎發(fā)生。組培條件下，植物再生是走器官發(fā)生途徑還是走胚狀體途徑，隨植物不同而不同，也隨培養(yǎng)基的不同而變化，有時甚至同一種植物在同一條件下，即存在體細胞胚胎發(fā)生途徑，也存在器官發(fā)生發(fā)生途徑，這都是自然現象，是正常的，只是兩種發(fā)育途徑的頻率隨著基因型不同和培養(yǎng)條件的改變而差異顯著。

　　第二部分 植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基成分組成

　　化學合成培養(yǎng)基大致由6種成分組成：

　　(1)糖類，

　　(2)多種無機鹽類，

　　(3)微量元素，

　　(4)氨基酸、酰胺、嘌呤：

　　(5)維生素;生長素。

　　此外，有些培養(yǎng)基還可添加天然的汁液，如椰子汁、酵母提取液、水解酪蛋白、麥芽浸出液等，培養(yǎng)基中如加入0.5～1%的瓊脂即為靜止培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基，否則為懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基。不同植物材料常需要改變配方，如維持生長和誘導細胞分裂和分化的培養(yǎng)基配方就不同，因此配方的種類很多，目前以Ms (Murashige and Skoog)培養(yǎng)基配方為最常用的一種基本培養(yǎng)基，它利于一般植物組織和細胞的快速生長。

　　在進行組織培養(yǎng)研究時應根據研究目的和培養(yǎng)植物的種類來確定培養(yǎng)基的組成，除營養(yǎng)、誘導作用外還應當注意離子平衡和毒性問題，如水一般都采用重蒸餾水，無機鹽類一般都需用化學純的藥品， pH值可用1N KoH(或NaOH)溶液和2N HCI調整。有時可以用普通藥品代替，但須注意這些藥品不僅應有營養(yǎng)價值，還須無毒。如果在工業(yè)上使用大缸深層培養(yǎng)細胞或組織生產有效成分和生物制品、應用培養(yǎng)基的量將要以噸位計量時，則采用什么代用品較為經濟實用更應慎重考慮。

　　第三部分 植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)條件

　　(一)溫度： 對大多數植物組織20～28℃即可滿足生長所需，其中26～27℃最適合。

　　(二)光： 組織培養(yǎng)通常在散射光線下進行。光的影響可導致不同的結果。有些植物組織在暗處生長較好，而另一些植物組織在光亮處生長較好，但由愈傷組織分化成器官時，則每日必須要有一定時間的光照才能形成芽和根。有些次生物質的形成，光是決定三因素。

　　(三)滲透壓： 滲透壓對植物組織的生長和分化很有關系。在培養(yǎng)基中添加食鹽、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物質可以調整滲透壓。通常1～2個大氣壓可促進植物組織生長，2個大氣壓以上時，出現生長障礙，6個大氣壓時植物組織即無法生存。

　　(四)酸堿度： 一般植物組織生長的最適宜pH為5～6.5。在培養(yǎng)過程中pH可發(fā)生變化，加進磷酸氫鹽或二氫鹽，可起穩(wěn)定作用。

　　(五)通氣： 懸浮培養(yǎng)中細胞的旺盛生長必須有良好的通氣條件。小量懸浮培養(yǎng)時巨常轉動或振蕩，可起通氣和攪拌作用。大量培養(yǎng)中可采用專門的通氣和攪拌裝置。

　　第四部分 植物組織培養(yǎng)材料與方法

　　從低等的藻類到苔蘚、蕨類、種子植物等高等植物的各類、各部分都可采用作為組織培養(yǎng)的材料，一般裸子植物多采用幼苗、芽、韌皮部細胞，被子植物采用胚、胚乳、子葉、幼苗、莖尖、根、莖、葉、花藥、花粉、子房和胚珠等各個部分。

　　由于植物在自然條件下，表面常被霉菌和細菌污染，故材料必須進行滅菌處理。一般用漂白粉溶液(1～10%)、次氯酸鈉溶液(0.5～10%)、升汞溶液(0.01%)、乙醇(70%)或過氧化氫(3～10%)等處理后，再用無菌水反復沖洗至凈，然后在無菌室內，將所取的組織迅速培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基上。在適宜的條件下，受傷組織切口表面不久即能長出一種脫分化的組織堆塊，稱為愈傷組織(Callus)，此種愈傷組織在適當的培養(yǎng)基上經一定時間即能誘導生長成整株植物，因此愈傷組織既可是某種植物代謝產物的來源，又是誘導成株的主要途徑之一。

　　在適宜的培養(yǎng)條件下，還可使愈傷組織長期傳代生存下去，這種培養(yǎng)稱為繼代培養(yǎng)。但在繼代培養(yǎng)中，不少植物培養(yǎng)的組織或細胞隨著再培養(yǎng)代數的增加，分化能力就逐漸降低甚至喪失，其原因可能是由于在培養(yǎng)過程中原有母體中存在的、與器官形成有關的特殊物質被逐漸消耗所致，因此可以用激素或改善營養(yǎng)條件使之恢復，也有認為是組織和細胞在長期培養(yǎng)中遺傳往的改變，主要是染色體的變化，出現大量多倍性或非整倍性細胞，這種改變恢復的可能住較小。不同的培養(yǎng)基可以使愈傷組織具有不同的生長速度，結構也可松可緊，利用這些特性可使之分散成為單細胞或很小的細胞團。要形成單細胞培養(yǎng)宜在較高鹽分、高生長素及高水解酪蛋白的培養(yǎng)基中進行，然后移入液體并經攪拌而分散成單細胞。也有用加入一些果膠酶的辦法，但一般來說要得到純一的單細胞是很少的。

　　在培養(yǎng)藥用植物選材時，還應考慮到所需要的次生物質在植物體中的合成部位，如果選材和培養(yǎng)方法適當，可使原植物內所產主的代謝物通過細胞或組織培養(yǎng)發(fā)生生化轉變而獲得。

　　通過組織培養(yǎng)可獲得有效成分，但實際上只有大量培養(yǎng)成功才有經濟價值。因此在生產上常采用懸浮培養(yǎng)法來代替含有瓊脂的固體培養(yǎng)基。愈傷組織懸浮培養(yǎng)的生長通常比靜止培養(yǎng)快，這是由于懸浮培養(yǎng)時營養(yǎng)成分可較快地滲入細胞，抑制生長的代謝廢物可較快地除去，同時供氧情況也較好，在進行這種培養(yǎng)時要注意通氣與定期更新營養(yǎng)液，這是保證生長穩(wěn)定，次生物質產量高的關鍵之一。

　　第五部分 植物組織培養(yǎng)再生的步驟

　　一、接種

　　組織培養(yǎng)的接種是指將滅過菌的材料，在無菌的情況下，切成小塊，放入培養(yǎng)基的過程?？蒲?、生產部門的接種工作，多在無菌室或超凈工作臺上進行，中學可制作接種箱，在箱內進行接種。接種的方法步驟如下：

　　1、在無菌室或接種箱中放好接種時所需要的酒精燈、貯存70%酒精和棉球的廣口瓶、各種鑷子、接種針、解剖刀、手術剪、火柴、培養(yǎng)基等。

　　2、在無菌室或接種箱內用紫外燈滅菌(無菌室照射20～50分鐘，接種箱照射15分鐘)。

　　3、放入已滅菌的接種材料(用培養(yǎng)皿盛取)。同時，操作人員用酒精棉球擦手，并對接種工具用酒精燈火焰燒灼。

　　4、用手術刀片將材料切割成若干片段，并迅速接種入培養(yǎng)基中。接種時，錐形瓶(或試管)應斜向火焰，在酒精燈火焰附近操作。

　　5、材料接種好后，將錐形瓶瓶口在酒精燈火焰上轉動燒一遍，蓋好瓶蓋，注明材料名稱及接種日期。

　　材料接種后，應置于26～28℃的培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)。

　　二、植株誘導

　　本階段是組織培養(yǎng)中最重要的一環(huán)。在培養(yǎng)基中植物激素的作用下，外植體通過三條途徑迅速增殖，這就是側芽增殖、誘導不定芽的形成和誘導胚狀體的形成。

　　1、側芽增殖

　　種子植物的每個葉腋中通常都存在著腋芽，在一定條件下可以使它生長?，F在知道頂端優(yōu)勢抑制側芽生長，可被外源的細胞分裂素打破，所以在利用側芽增殖這條途徑時，培養(yǎng)基中幾乎都要加入細胞分裂素(有時也加入少量生長素)。由于細胞分裂素的持續(xù)作用，側芽不斷分化和生長，逐漸形成芽叢。如果反復切割和轉移到新的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，就可在短期內得到大量的芽。 側芽增殖的主要優(yōu)點是能保持遺傳的穩(wěn)定性，因為莖尖的細胞常是均一的二倍體細胞，它不易受培養(yǎng)條件的影響而發(fā)生變異，也易于保持嵌合體的性狀。目前已有近百種植物可以用這種方法進行繁殖，如草毒(Fragaria ananassa Duch.)、蘋果、葡萄(Vitis vinifera L.)、唐菖蒲(Gladiolus gandavensis Houtt.)、非洲菊、月季(Rosa chinensis Jacq.)、甜菜(Beta vulgaris L.)和鳳梨(Ananas comosus(L.) Merr.)等。 關于培養(yǎng)基中加入細胞分裂素的濃度，是0.1～10.0毫克/升，一般為1.0～2.0毫克/升。在幾種細胞分裂素中用的最多的是6-芐基嘌呤，其次是激動素和異戎基腺苷，玉米素用的很少。 除了細胞分裂素之外，在培養(yǎng)基中還經常加入低濃度的生長素以促進腋芽的生長。常用的生長素是萘乙酸、吲哚丁酸和吲哚乙酸(濃度為0.1～1.0毫克/升)。

　　2、不定芽的誘導形成

　　在自然條件下，很多種植物的器官可以產生不定芽。在培養(yǎng)條件下，由于所需要的外植體很小又加上激素的作用，可以使這種產生不定芽的能力得到極好的發(fā)揮，如秋海棠或非洲紫羅蘭(Saintpaulia ionantha Wendl.)用常規(guī)的葉插法繁殖時，每片葉只能產生幾個到十幾個芽，但用葉切段在培養(yǎng)基中可產生成千上萬個芽。在培養(yǎng)條件下，還能使自然條件下不產生不定芽的器官形成不定芽，如卷心菜(Brassica oleracea L.var.capi-tata L.)和番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)的葉、菊花[Dendranthema morifolium(Ram.) Tzvel.]的花和葉片、百合(Lilium brownii F.E.Br.var.viridulum Baker)和水仙的鱗片以及萱草(Hemerocallis fulva L.)的花莖等。 在誘導外植體形成不定芽時，一般使用細胞分裂素高于生長素比值的激素配比，少數情況下也采用二者比值接近1的配比。常用的細胞分裂素是6-芐基嘌呤，激動素和玉米素，濃度范圍一般在0.1～10.0毫克/升。生長素是萘乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸，其濃度范圍與細胞分裂素相同。為了使外植體形成不定芽，外源激素的供應只是一個方面，器官分化的性質還要決定于內源激素的狀況。因此，對于不同的植物，使用的激素種類和濃度常有較大的變化。在具體操作時，應參考已有資料或相近種類的已有結果，以確定適當的濃度和配比。

　　3、胚狀體的誘導形成

　　在自然界只有少數植物可以由珠心產生胚狀體。在培養(yǎng)條件下，現在已有30多個科的150多種植物可以產生胚狀體。在誘導胚狀體的形成時，其外植體一般取自胚、分生組織或生殖器官。為了獲得胚狀體，在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中應含有豐富的還原氮，并加入生長素(主要是2，4-D)誘導胚狀體的發(fā)生。待胚狀體發(fā)生后，要轉移到降低濃度或沒有生長素的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，使胚狀體成熟和生長。

　　胚狀體途徑的優(yōu)點是增殖率高，而且胚狀體既具胚芽又具胚根。因此，可免去生根這一步驟。但目前很多重要作物還不能形成胚狀體，或產生的胚狀體難以形成植株，另外胚狀體遺傳性也容易發(fā)生變異，所以目前除柑桔(Citrus)、油棕(Elaeis guine-ensis Jacq.)和咖啡(Coffea)等少數作物外，都不采用這一途徑。

　　三、生根

　　生根是獲得完整植株的一個關鍵。通過側芽和不定芽途徑產生的芽長成嫩枝后(此時的嫩枝叫試管苗)，必須誘導生根才能移植。促使試管苗生根的方法通常有兩種。一種是在固體培養(yǎng)基上誘導生根。當試管苗長到2～3厘米高時，將它從基部切下，轉移到只含0.2～0.5毫克/升的萘乙酸或吲哚丁酸的固體培養(yǎng)基上生根。另一種是浸泡的方法，將切下的無根試管苗泡在含有高濃度生長素溶液中，生長素濃度為100毫克/升左右，浸泡時間從幾小時到1天，然后取出接種于不加任何激素的MS培養(yǎng)基上，十天左右即可生根。

　　以上兩種方法，在更換培養(yǎng)基后，經過幾天，都要將試管苗的瓶口打開，上蓋1～2層紗布，以便于通氣。并要適當加強光照，以增加試管苗的自養(yǎng)能力。

　　四、移栽

　　當試管苗的根原基突起或形成幾毫米長的短根時，將其取出，洗去瓊脂，載入有少量營養(yǎng)的人工基質中。移栽后，保持高濕度，避免陽光直射和過大的溫度波動，經過一段逐步鍛煉的過程，再定植到土壤中。

　　在移栽過程中，試管苗的環(huán)境條件發(fā)生了劇烈的變化，其本身又從異養(yǎng)變到自養(yǎng)，葉的光合作用和根的吸收作用需要逐漸發(fā)展。因此移栽時要小心控制，使試管苗逐步鍛煉，最終能在土壤中生活。

　　第六部分 植物組織培養(yǎng)苗之污染來源與污染鑒定

　　一、在組織培養(yǎng)中污染來源

　　1. 植物本身具有：

　　(1)植物病原菌 有些作物的病害已被透徹研究，因此在大量繁殖時，可立即檢查出來，但有些則否，造成若有污染時，不知來源為何。

　　(2)和植物有關的菌類 有修植物本身便會和一些菌種共生，或是寄生于植物內部。

　　2. 植物所帶入的污染：內在污染源

　　許多植物表面或大氣中生存的微生物，可經由植物自然的開口或傷口進如植物內部，而有一些兼性腐生菌或絕對寄生菌，可藉由載體或是擁有一些侵入的機制侵入植物內部，依其存在的地方分為

　　1. 細胞內-inter 2. 細胞間隙-interacellular 種類有：virus病毒、viroids類病毒、prokarytoes原核生物、fungi真菌、柔膜綱(ex:mite)、立克次體。

　　3. 操作室：外在污染源

　　在組織大量培養(yǎng)下，除了植物本身外，大部分最有可能的污染來源便是來自操作室。依其可能原因分析為：

　　(1)空氣

　　在操作室中，未過濾空氣帶有大量的微生物，隨者操作人員或植株接觸時，而污染培養(yǎng)皿。故在國外對于操作室內空氣的清潔度分為四種等級：

　　ClassⅠ.沒有容易培養(yǎng)的微生物，和作物之主要病原菌

　?、?沒有容易培養(yǎng)的微生物，和作物特殊病原菌

　?、?沒有容易培養(yǎng)的微生物

　?、?未做檢測

　　(2)不完全的滅菌設備或技術

　　因為使用滅菌不完全的設備或是技術，而導致植株或培養(yǎng)皿的污染，例如：有些酵母菌，可避免酒精消毒，還有一些會產生內孢子，而避免火焰消毒。

　　(3)人員

　　在整個操作室內，人員可說是最大的帶菌者，其不管在毛發(fā)或是衣服等，都隱藏屬不清的菌。在進入操作室前，最好能將作業(yè)人員清潔處理，然后換上脫鞋，或是將塵土去掉。

　　(4)細縫的存在 因為若操作室有細縫的存在，則造成外果氣體直接流入，使得空氣中菌數增加。

　　(5)操作臺上的濾網不干凈 因為使用過久，或不當保養(yǎng)，而造成濾網壞掉，而產生更多的污染。

　　(6)蹣及薊馬的存在 此為珠形網，具有活動能力，能到處跑來跑去。因此常造成散亂的污染。

　　4.栽培過程污染 在栽培室，組培瓶外和外界氣體交換時，亦會有污染進入。污染機率取決于空氣中帶菌密度與組培瓶空氣交換率。

　　二、污染的種類及形式

　　1. 污染的形成 依據污染的來源，可將污染分為三個形式：

　　a.由植物內部或病原菌所造成的污染 植物內部或病原菌所造成的污染，所呈現是系統(tǒng)性，及從stageo~stage4中都可發(fā)現，而且占有一定的百分比。

　　b. 在制造時所造成的污染 如因蹣或是空氣中的關系造成的污染，其所表現的方式是散亂(random)性非系統(tǒng)性，且不集中于某一地方，占的百分比也不一定，是機率性。

　　c. 技術上的失誤 其呈現方式有一定性，例如由此工作臺所生產得植株都被污染，表現為帶狀性，可用卷標方式來追蹤，以進而改善。

　　2. 污染的來源分類

　　A、污染的種類，以總體來說可分為下列幾種：

　　a.病毒(virus)-常存在植物內部。 b.(viroids)常存在植物內部 c.細菌-在組織培養(yǎng)中又分依其來源和所在地方分類如下：

　　(a) phlem-eimited生長于韌皮部

　　xylem-eimited生長于木質部

　　(b)植物病原細菌

　　(c)空氣中存在的細菌，但因植物有傷口，或是營養(yǎng)豐富的地方，可分為植物表面的細菌或植物內部的細菌。

　　例如：Bacillus spp.可抗熱，在不完全滅菌的玻璃器皿中可發(fā)現。

　　(d)菌質體 是一種像細菌的微生物，但是本身沒有細胞壁，可以在培養(yǎng)基培養(yǎng)，亦可用特殊的抗生素(四環(huán)霉素)抑制其生長。其種類有microplasm與spiroplasm。

　　(e)真菌

　　在植物病害中，真菌所引起的病害特別多且嚴重，且因其會產生孢子，所以會隨著空氣飄散。一旦落于適當的環(huán)境下，一粒小小的孢子便會擴大成一個菌落，污染整個組織培養(yǎng)瓶。例如常見的酵母菌，其菌落為粉紅色，若有其出現，則其污染來源可能來自空氣。

　　(f)蹣或薊馬 此為細小的微生物，具有活動能力，喜歡吃菌絲。在國內使用期限較久的組培場中常出現此問題。

　　(g)立克次體 目前未清楚其污染方式。

　　B、以培養(yǎng)難易區(qū)分污染源

　　1. 在培養(yǎng)基中易培養(yǎng)菌類 細菌，真菌，蹣。

　　2. 在培養(yǎng)基中不易培養(yǎng)的菌類 病毒，類病毒，立克次體，菌質體。

　　在組織培養(yǎng)過程中，常造成污染或是造成威脅的菌類，稱為培養(yǎng)菌類。因常為腐生菌，且營養(yǎng)需求不高(隨便吃，隨便活)所以常造成成本的增加。而且污染后，常使培養(yǎng)基的pH值降低，洋菜無法凝結，而使植物無法生長或是產生有毒物質或副產品，使得植物生長緩慢，或是干脆就在植物上生長。在培養(yǎng)基上不易培養(yǎng)或是不能培養(yǎng)的菌種，就不會造成太大的威脅。

　　C、各種菌種其主要傳播方式

　　1. 病毒，類病毒，菌質體-常利用機械或利用有載體傳播。

　　2. 細菌-可經人力，氣流或水，及昆蟲等傳播。

　　3. 真菌-亦同上，但孢子可經空氣傳播。

　　4. 薊馬-同上，具活動力，自由運動，應慎防出現。

　　D、依其菌落生長出現的快慢區(qū)別

　　1. 可見的菌落在組織培養(yǎng)中。一些易培養(yǎng)的菌類，其生長特性為快速蔓延整個組培瓶。但此種污染可利用工作人員之視覺觀察將之偵測出來將之銷毀，對后代植株造成威脅不大。

　　2. 潛藏的菌落-在組織培養(yǎng)中有些不易培養(yǎng)或是在植物內部寄生或共生的菌類或病原菌，在培養(yǎng)時沒有表現出來，但是有存在或只有很微弱的表現，但是未被察覺出來。于是便造成了對后代植株的重大威脅及成本的增加。

　　其污染未明顯表現出的原因有下列幾項：

　　a在培養(yǎng)基中含有抗生素，則菌類不易生長。.

　　b.在培養(yǎng)基中，因植物本身的汁液含有某些特殊的成分例如：單寧酸，因此抑制菌類表現。

　　c.培養(yǎng)基成分不適合其大量表現，可能因營養(yǎng)需求不同。

　　c. 本身菌類生長方式不同：

　　例如病毒為絕對寄生菌，無法在一般培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

　　E、依其植物棲息的地方分為：

　　1. 植物表面棲息的菌類 如：細菌，真菌。

　　2. 在植物內部共生寄生的菌類： 如：病毒，類病毒，細菌，真菌，菌質體。

　　3. 在大氣中游移的菌種 細菌，真菌，蹣。

　　三、污染種類的鑒定方式

　　1. 針對培養(yǎng)難易菌種鑒定方式

　　A、針對易培養(yǎng)的菌種：其種類為真菌，細菌

　　a.就真菌而言，主要是利用顯微鏡，視其孢子形態(tài)、產孢結構、及菌絲有無隔膜、還有細胞壁之形成加以鑒定。目前亦有使用DNA探針加以分析。

　　b.就細菌而言，則是利用其特殊的生化反應，或是利用選擇性的培養(yǎng)基。目前亦有如用fatty acid profiling技術和商業(yè)化的test kits加以鑒定。 B、不易培養(yǎng)的菌種，如菌質體，病毒，類病毒。

　　a.就菌質體而言，主要是觀察其在培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)。

　　b.病毒而言，分析其核酸的組成與例子的外形。 類病毒因沒有套膜，以上兩種常利用其DNA有同源性而做探針偵測。

　　C、病原菌的偵測

　　利用柯霍氏法來測其病源性。而利用分子診斷，如血清、ELISA、DNA序列、核酸的探針以鑒定種類。

　　2. 鑒定菌種常用的方式與應用的微生物種類 方法 目標微生物 無種別性 指示培養(yǎng) 所有可培養(yǎng)的細菌 DNA/RNA 螢光染色法 菌質體及有關原核生物 Leaf dip electon microscopy 長條狀的病毒，其數目較多者亦適用 電泳 類病毒 有種別性 ELISA 細菌及病毒 PALIAS 細菌及病毒 ISEM 病毒 DNA探針 所有微生物 快速診斷的 kits 細菌 Fatty acid profiling 細菌

　　第七部分 植物組織培養(yǎng)的應用

　　快速繁殖優(yōu)良植物株系

　　組織培養(yǎng)具有時間短、增殖率高和全年生產等優(yōu)點，比大田生產快得多。加上培養(yǎng)材料和試管苗的小型化，這就可使有限的空間培養(yǎng)出大量個體。例如蘭花(Cymbidium)、桉樹(Eucalyptus)、楊樹、秋海棠等植物，用一個莖尖或一小塊葉片為基數，經過組織培養(yǎng)，一年內可以增殖到10000～100000株，繁殖速度如此快，說明組織培養(yǎng)對于短期內需要大量繁殖的植物，如引入的優(yōu)良品種、優(yōu)良單株、育種過程中優(yōu)良子代的擴大等，特別有用，而且對一些難以繁殖或繁殖很慢的名貴花卉、果木及稀有植物，同樣具有重要意義。

　　培育作物新品種

　　用組織培養(yǎng)方法培育作物新品種，已經取得了多方面的成就。例如利用組織培養(yǎng)解決雜交育種中的種胚敗育問題，獲得了雜種子代，使遠緣雜交得以成功;用花藥培養(yǎng)和對未傳粉的子房進行離體培養(yǎng)，獲得了單倍體植株，從而開辟了單倍體育種的途徑;通過胚乳離體培養(yǎng)，獲得了三倍體植株，為改良農、林、果樹和蔬菜的三倍體育種提供了新的方法;此外還有利用原生質體培養(yǎng)及體細胞雜交進行天然突變系的篩選、外源遺傳物質的導入等等。

　　獲得無病植株

　　作物的病毒病害，是當前農業(yè)生產上的嚴重問題。尤其是營養(yǎng)繁殖的作物，病毒可以經繁殖用的營養(yǎng)器官傳至下一代，以致隨著作物繁殖代數的積累，病毒不僅綿延不絕，還會日益增多。其結果能使作物退化減產，甚至導致某些品種絕滅。

　　根據病毒在植物體內分布并不均勻的特點，用生長點進行組織培養(yǎng)，結合病毒鑒定，可以得到無病毒植株。這就可以使植株復壯，并能增加產量。在這方面，馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)、水仙(Narcissus tazatia L. var. chinensis Roem)、蘋果、梨(Pyrus)和花椰菜(Brassica oleracea var.bo-trytis L.)等作物，都取得了明顯效果。

　　保存和運輸種質

　　由于有了組織培養(yǎng)方法，就無需再用一代代保存種子的方法去保存種質資源，而可以將植物器官、組織甚至細胞，在低溫或超低溫條件下進行長期保存。將來一旦需要，就可用組織培養(yǎng)方法迅速進行繁殖。這樣不但大大減少了一代代保存材料所浪費的人力、物力和時間，而且也減少了在保存過程中因管理不善及病蟲侵害所造成的損失。另外，由于用很小的空間保存了大量的種質資源，運輸時也很方便。