植物組培室培養(yǎng)基的成分

　　培養(yǎng)基是人工配制的，滿足不同材料生長，繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)物質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種類植物對營養(yǎng)的要求不同，甚至同一種植物不同部位的組織以及不同培養(yǎng)階段對營養(yǎng)要求也不相同。篩選合適的培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)極其重要的內(nèi)容，是決定成敗的關鍵因素之一。

　　大多數(shù)植物組織培養(yǎng)基的主要成分是無機營養(yǎng)物質(zhì)（大量營養(yǎng)元素和微量營養(yǎng)元素）、碳源、有機添加物、植物生長調(diào)節(jié)劑和凝膠劑。一些組織可以生長在簡單的培養(yǎng)基上，這些培養(yǎng)基只含無機鹽和可利用的碳源（蔗糖），但大多數(shù)組織必須在培養(yǎng)基中添加維生素、氨基酸和生長物質(zhì)，而且經(jīng)常還將一些復合的營養(yǎng)物質(zhì)加入到培養(yǎng)基中，這種由“化學定義”的化合物組成的培養(yǎng)基稱為“合成”培養(yǎng)基。

　　1、水分

　　水分是植物體的主要組成部分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒，在植物生命活動過程中不可缺少。配制培養(yǎng)基母液時要用蒸餾水或純水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止儲藏過程中發(fā)霉變質(zhì)。研究培養(yǎng)基配方時盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。而在大規(guī)模工廠化生產(chǎn)時，為了降低生產(chǎn)成本，常用自來水代替蒸餾水。如自來水中含有大量的鈣、鎂、氯和其他離子，好將自來水煮沸，經(jīng)過冷卻沉淀后再使用。

　　2、無機營養(yǎng)成分

　　除了碳（C）、氫（H）、氧（O）外，已知還有12種元素對植物的生長是必需的。根據(jù)植物生長需求量的多少將這些無機營養(yǎng)元素分為大量元素和微量元素兩類。

　　各種礦質(zhì)元素（鹽）為植物生命活動提供必需的大量營養(yǎng)元素和微量元素。需要量大于0.5mmol/L濃度的元素稱為大量元素,小于0.5mmol/L稱為微量元素。當無機鹽溶于水中時，無機鹽發(fā)生分解和電離作用。培養(yǎng)基中的一種離子可能由幾種鹽分解而來。如MS培養(yǎng)基中的NO3-離子由NH4NO3和KNO3提供，K+離子由KNO3和KH2PO4提供。因此，計算總離子濃度有利于比較不同的培養(yǎng)基，探討特定組織或培養(yǎng)體系的適宜培養(yǎng)基。

　?。?）大量元素

　　指培養(yǎng)基中濃度大于0.5mmol/L的元素，包括氮（N）、磷（P）、鉀（K）、鈣（Ca）、鎂（Mg）、硫（S）。

　　它們以無機鹽的形式存在于各種培養(yǎng)基中，對植物細胞和組織生長都是必不可少的。培養(yǎng)基至少應含有25mmol/L的NO3-和K+。不過，如果以硝酸鹽和氨鹽（2~20mmol/L）或其他任何還原性氮作為培養(yǎng)基的氮源，都能獲得非常好的餓實驗結(jié)果。如果只使用銨鹽作為唯一的氮源，則需要加入一種或多種三羧酸（TCA）循環(huán)的羧酸（如檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或蘋果酸鹽），以便減輕培養(yǎng)基中氮濃度超過8mmol/L產(chǎn)生的毒害。當硝酸銀和氨離子共同存在于培養(yǎng)基中時，氨離子更迅速的被利用。另一些大量元素，如Ca、P、S和Mg，在其他營養(yǎng)需要滿足下他們的適宜濃度為1~3mmol/L。

　　氮參與蛋白質(zhì)、核酸、酶、葉綠素、維生素、磷脂、生物堿等物質(zhì)構(gòu)成，是生命不可缺少的物質(zhì)。缺氮時，老葉先發(fā)黃；氮過量，枝葉會過度茂盛。氮主要以銷態(tài)氮和銨態(tài)氮兩種形式被使用，常使用的含氮物質(zhì)有KNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4等，大多數(shù)培養(yǎng)基將銷態(tài)氮和銨態(tài)氮兩者混合使用，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的離子平衡。

　　磷參與磷脂、核算、酶及微生物等多種生理活性物質(zhì)構(gòu)成，在植物碳水化合物的運輸和代謝中起著極其重要的作用，磷直接參與呼吸作用和發(fā)酵過程，與光合作用也有直接關系。缺磷時植株生長緩慢，老葉暗紫色。磷常由KH2PO4、NaH2PO4提供。

　　鉀對碳水化合物合成、轉(zhuǎn)移以及氮素代謝等有密切關系。鉀增加時，蛋白質(zhì)合成增加，維管束、纖維組織發(fā)達，對胚的分化有促進作用。缺鉀時葉尖、葉緣枯焦，葉片呈皺曲狀，老葉發(fā)黃或火燒狀。常用的含鉀化合物有KCl、KNO3、KH2PO4等。

　　鎂是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，缺鎂時葉片邊緣及中央部分失綠而變白，鎂常以MgSO4來提供。

　　鈣是構(gòu)成細胞壁的一種成分，鈣對細胞分裂、保護膜不受破壞有顯著作用。缺鈣時嫩葉失綠，葉緣向上卷曲，出現(xiàn)白色條紋。常以CaCl2提供。

　?。?）微量元素

　　指培養(yǎng)基中濃度小于0.5mmol/L的元素，有鐵（Fe）、硼（B）、錳（Mn）、銅（Cu）、鉬（Mo）、鈷（Co）等.微量元素也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會導致生長、發(fā)育異常。其中鐵似乎更重要，因為配制培養(yǎng)基中常使用螯合鐵和螯合鋅。酒石酸鐵和檸檬酸鐵難溶解，經(jīng)常在培養(yǎng)基中發(fā)生沉淀。使用乙二胺四乙酸（EDTA）-鐵螯合物代替檸檬酸鐵，特別是胚胎誘導中，可以克服沉淀產(chǎn)生的問題。微量元素是許多酶和輔酶的重要組成成分，生理作用主要體現(xiàn)在酶的催化功能和細胞分化、維持細胞的完整機能等方面。如鐵是多種氧化酶和葉綠素的重要成分，而且是維持葉綠體功能所必需的；銅有促進離體根生長的作用；鉬是合成活躍的硝酸還原酶所必不可少的元素，也是固氮酶的組成部分，還有防止葉綠素受破壞的作用；鋅是酶的組成成分，也有防止葉綠素破壞的作用；錳與植物呼吸作用、光合作用有關；硼與糖的運輸、蛋白質(zhì)的合成有關。 當某些微量元素供應不足時，植物表現(xiàn)出一定的缺素癥狀。如缺鐵，綠葉變黃，進而發(fā)白；缺錳，葉片上出現(xiàn)缺綠斑點或條紋；缺鋅，葉片發(fā)黃，或出現(xiàn)白斑，葉子??；缺硼，葉失綠，葉緣向上卷曲，頂芽死亡；缺鈷葉片失綠而卷曲，整個葉片向上彎曲凋枯。

　　3、碳源和能源

　　植物組織培養(yǎng)適合的碳源是蔗糖。葡萄糖同樣有利于植物組織生長，而果糖產(chǎn)生的效力較低。培養(yǎng)基高壓滅菌時，蔗糖轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟呛凸恰Ｔ谂囵B(yǎng)過程中，先利用葡萄糖，然后利用果糖。 植物細胞和組織在培養(yǎng)基中缺乏自養(yǎng)能力，因此，需要外源碳源提供能量。在培養(yǎng)期間的特殊條件下，即使組織開始變綠或產(chǎn)生綠色色素，培養(yǎng)組織生產(chǎn)的碳源也不能自給自足。將外源碳源加入到培養(yǎng)基后，可增強細胞增殖和綠莖再生能力。除此之外，糖類的添加還有調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓的作用。在培養(yǎng)基高壓滅菌過程中，部分蔗糖發(fā)生水解。但是，培養(yǎng)物在高壓滅菌的蔗糖培養(yǎng)基上生長較好，而在過濾消毒的蔗糖培養(yǎng)基上次之。從這個結(jié)果可以推論出，高壓滅菌使蔗糖水解成葡萄糖和果糖，有利于細胞生長和分化。在大規(guī)模生產(chǎn)中，蔗糖價格太貴，常用食用綿白糖、白砂糖代替蔗糖，但在不同的植物種類上，其使用的可行性及其濃度范圍需要做小規(guī)模的生產(chǎn)性實驗。

　　4、有機營養(yǎng)成分

　?。?）維生素

　　植物合成的內(nèi)源維生素，在各種代謝過程中起著催化劑的作用。當植物細胞和組織離體生長時，也能合成一些必需的維生素，但不能達到植物生長的佳需要量。因此，必須在培養(yǎng)基中添加必需的維生素和氨基酸，使植物組織健壯生長。比較常用的維生素是鹽酸硫胺素（VB1）、鹽酸吡哆醇（VB6）、煙酸（VB3）、肌醇等，鹽酸硫胺素是所有細胞和組織必需的基本維生素。煙酸和鹽酸吡哆醇常添加到培養(yǎng)基中，但對許多植物的細胞可能不是必需的。其他維生素如生物素（VH）、葉酸、抗壞血酸（VC）、泛酸鈣、維生素E（生育酚）、核黃素和對氨基苯甲酸也常被使用。氨基酸類物質(zhì)不僅為培養(yǎng)物提供有機氮源，同時也對外植體的生長以及不定芽、不定胚的分化起促進作用?？箟难徇€有防止組織褐變的作用。     （2）氨基酸

　　氨基酸是蛋白質(zhì)的組成成分，也是一種有機氮化合物。常用的氨基酸有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、半胱氨酸以及多種氨基酸的混合物，如水解酪蛋白（CH）、水解乳蛋白（LH）等。氨基酸類物質(zhì)不僅為培養(yǎng)物提供有機氮源，同時也對植物體的生長及不定芽、不定胚的分化起促進作用。與無機氮不同，氨基酸能被植物細胞很快吸收。

　　5、植物生長調(diào)節(jié)劑

　　（1）生長素

　　生長素由莖尖合成，沿植物體向下運輸，常用的生長素有吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和萘氧乙酸（NOA）等。IAA和IBA見光易分解，故應置于棕色瓶中，IAA在高溫滅菌時會受到破壞，好采用過濾除菌方法。 在植物組織培養(yǎng)中，生長素的主要作用有：①誘導愈傷組織的產(chǎn)生，促進細胞脫分化；②促進細胞的伸長；③促進生根；④2，4-D會誘導某些植物不定胚的形成。

　　生長素通常溶解于乙醇或低濃度的氫氧化鈉溶液中。（2）細胞分裂素 細胞分裂素由根尖合成，沿植物體向上運輸。細胞分裂素是腺嘌呤的衍生物。常用的細胞分裂素有6-芐氨基嘌呤（6-BA）、激動素（KT）、玉米素（ZT）、2-異戊烯腺嘌呤（2-ip）、噻苯?。═DZ）、氯苯脲（CPPU）等。     在植物組織培養(yǎng)中，細胞分裂素的主要作用有：①促進細胞分裂和擴大，使莖增粗，而抑制莖伸長；②誘導芽的分化，促進側(cè)芽萌發(fā)生長；③減少葉綠素的分解，抑制頂端優(yōu)勢，延緩離體組織或器官的衰老，有保鮮的效果；④對根的生長一般起抑制作用。

　　在植物組織培養(yǎng)時，細胞分裂素/生長素的比值控制器官發(fā)育模式，若增加生長素濃度，有利于根的形成；增加細胞分裂素濃度則促進芽的分化。

　?。?）赤霉素（GA）和脫落酸（ABA）這2種植物生長調(diào)節(jié)劑不常用于組織培養(yǎng)中。一些植物需要赤霉素和脫落酸增強生長，而在另一些植物中需要它們抑制生長。GA3是20多種赤霉素中常用的，GA3能促進低密度培養(yǎng)細胞的生長，增加愈傷組織生長，誘導矮化或發(fā)育遲緩的植物伸長生長。GA3好現(xiàn)配現(xiàn)用，過濾滅菌后加入到培養(yǎng)基中。

　　根據(jù)植物種類不同，脫落酸在培養(yǎng)基中刺激或抑制愈傷組織生長。據(jù)報道，脫落酸有利于胚胎培養(yǎng)。脫落酸還有抑制生長、促進休眠的作用，在植物種質(zhì)資源超低溫冷凍保存時，可以用來促使植物停止生長和抗寒力的形成，從而保證冷凍保存的順利進行。

　　6、其它物質(zhì)

　?。?）天然有機添加物

　　培養(yǎng)基經(jīng)常添加各種成分不確定的天然有機提取物。常用的有椰子汁（CM）、酵母提取物（YE）、番茄汁、香蕉泥和土豆汁等。

　　由于天然有機物質(zhì)成分復雜，常因品種、產(chǎn)地和成熟等因素而變化，實驗的重復性比較差。另外，有些天然有機物質(zhì)還會因高壓滅菌而變性，從而失去效果，這時應該采取過濾的方法進行滅菌。     （2）活性炭（AC）

　　培養(yǎng)基中添加活性炭的主要作用是利用其吸附能力，減少一些有害物質(zhì)的影響，例如防止酚類物質(zhì)引起組織褐變死亡；活性炭使培養(yǎng)基變黑，有利于某些植物生根；活性炭還可降低玻璃化苗的產(chǎn)生頻率，對防止產(chǎn)生玻璃苗有良好作用。

　　但活性炭對物質(zhì)吸附無選擇性，既吸附有害物質(zhì)，也吸附必需的營養(yǎng)物質(zhì)，如在非洲菊繼代培養(yǎng)過程中，相同的繼代培養(yǎng)基，添加2.0mg/L活性炭后，其增殖系數(shù)大大降低，因此使用時應慎重考慮，不能過量，一般用量為1~5mg/L。高壓滅菌前加入活性炭會降低培養(yǎng)基的pH值，使瓊脂不易凝固，因此要加大瓊脂用量。

　?。?）抗生素

　　培養(yǎng)基中添加抗生素可防止菌類污染，減少培養(yǎng)材料損失。低濃度鏈霉素和卡那霉素能有效的控制微生物的系統(tǒng)侵染。常用的抗生素有青霉素、鏈霉素、慶大霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素等，用量一般為5~20mg/L。大部分抗生素需要過濾滅菌。

　?。?）硝酸銀

　　離體培養(yǎng)基中植物組織會產(chǎn)生和散發(fā)乙烯，而乙烯在培養(yǎng)容器中的積累會影響培養(yǎng)物的生長和分化，嚴重時甚至導致培養(yǎng)物的衰老和落葉。硝酸銀中的Ag+通過競爭性地結(jié)合于細胞膜上的乙烯受體蛋白，從而可起到抑制乙烯活性的作用。硝酸鹽的使用濃度一般為1~100mg/L，使用前過濾除菌。

　?。?）抗氧化物

　　植物組織在切割時會溢泌一些酚類物質(zhì)，滲出細胞外就造成自身中毒，使培養(yǎng)材料生長停頓，失去分化能力，終變褐死亡。在木本尤其是熱帶木本及少數(shù)草本植物中較為嚴重。常用的抗酚類氧化劑有半胱氨酸、聚依稀吡咯烷酮及抗壞血酸，可用濃度為50~200mg/L的抗酚類氧化劑洗滌剛切割的外植體傷口表面，或過濾除菌后加入固體培養(yǎng)基的表層。

　?。?）凝固劑

　　由于在靜止液體培養(yǎng)中，組織或細胞浸沒在培養(yǎng)基中，發(fā)生缺氧死亡。在配制固體培養(yǎng)基時，需要使用凝固劑。常用的凝固劑是瓊脂，瓊脂是一種來源于海藻的多聚糖，比其他膠凝劑的優(yōu)點多：第一，瓊脂凝膠不與培養(yǎng)基組分起反應；其次，它們不會被植物細胞分泌的各種酶降解，在所控制的培養(yǎng)溫度中保持穩(wěn)定。瓊脂本身并不提供任何營養(yǎng)，它是一種高分子的碳水化合物，在90℃以上熱水中溶解成為溶膠，冷卻至40℃可凝固為固體凝膠。

　　瓊脂有粉狀和條狀之分，現(xiàn)在絕大多數(shù)使用的是瓊脂粉。瓊脂的使用濃度應適當，如果濃度過高，會使培養(yǎng)基變得很硬，營養(yǎng)物質(zhì)難以擴散，不利于植物體吸收營養(yǎng)；若濃度過低，凝固性差。瓊脂的凝固能力還與高壓滅菌時的溫度、時間、pH值等因素有關。另一種凝固劑是卡拉膠，也是一種海藻提取物，價格比瓊脂便宜，但有些植物培養(yǎng)效果不理想。